申克孢子丝菌双相型转换相关基因功能研究

【摘要】申克孢子丝菌是一种重要的双相型真菌，是孢子丝菌病的主要病原菌。近年来，免疫缺陷或受损患者的增加，导致全球范围内孢子丝菌病发病率逐年升高，且深部和系统性孢子丝菌病的病例不断增多，已严重地影响到人类的健康，引起了广泛的关注、成为研究的热点之一。本研究以申克孢子丝菌为研究对象，利用反向遗传学、生物信息学及分子生物学等手段，首次建立了分离自肺孢子丝菌病患者的申克孢子丝菌分离株的T-DNA插入突变体库；筛选并鉴定双相型转换相关基因；通过构建基因敲除株和回复突变株来解析基因功能，以此明确双相型转换相关机制，为深入研究申克孢子丝菌的致病机制、防控孢子丝菌及新型抗真菌药物的研发病奠定理论基础和提供科学依据。1.申克孢子丝菌IFM41598的T-DNA插入突变体库的建立本研究首次利用根癌农杆菌介导的T-DNA插入技术建立了申克孢子丝菌IFM41598的T-DNA插入突变体系，具体条件为：将浓度为2106个/mL的申克孢子丝菌分生孢子与OD值为0.5-0.8的携带pBHt1质粒的根癌农杆菌AGL-1等比例混合，在存在200μMAS的条件下，诱导培养48h，经150μg/mL浓度的潮霉素筛选，25培养5d可获得800个转化子/2106个分生孢子，经过多次转化，共获得了转化子3000株，初步建立了申克孢子丝菌IFM41598的T-DNA插入突变体库。这一突变体库的建立将为研究深部和系统性孢子丝菌病的病原菌提供材料，为解析基因功能，探讨致病机制奠定基础。2.双相型转换相关基因的筛选和鉴定利用已经建立的突变体库，以库中3000株突变体为研究材料，利用平板法对双相型转换发生改变的突变体进行筛选，共计筛选获得18株形态转换发生异常的突变体；利用TAIL-PCR技术、测序技术及生物信息学分析，定位了6株突变体的打断序列，分别为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因2个、交配性基因2个、己糖转运蛋白基因及自然抗性相关巨噬细胞蛋白基因。3.双相型转换相关基因敲除株和回复突变株的构建利用分子克隆技术、重叠延伸PCR技术及PEG介导的原生质体转化技术构建了丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因（STPK）和己糖转运蛋白基因的敲除株；利用Split-Marker重组技术和PEG介导的原生质体转化技术获得了两个交配性基因的敲除株；利用酶切和连接方法结合根癌农杆菌介导的转化技术获得了丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（STE）基因和自然抗性相关巨噬细胞蛋白基因的敲除株；利用吡啶硫胺素作为第二抗性构建了上述6株基因敲除株对应的回复突变株。构建的双相型转换相关基因敲除株和回复突变株，将为解析这些基因功能和阐明双相型转换相关机制提供材料保障，多种方法实现了对申克孢子丝菌进行基因敲除为研究其他真菌提供技术支撑。4.双相型转换相关基因功能研究对基因敲除株的形态学改变、药物敏感性改变、细胞组成成分改变及致病力改变进行研究。六株菌的的形态均有不同程度的改变，主要变化为菌落颜色改变、分生孢子产生减少、菌落酵母相形成障碍等方面；六株菌的对药物的普遍抵抗能力均有所下降；细胞组分有不同程度增加；菌株的致病力均有不同程度的降低。上述结果表明申克孢子丝菌双相型转换是由多种原因引起的，解析相关基因功能，明确相关作用机制将为双相型真菌的形态转换、致病机制及感染的防治等研究提供参考和根据。综上，本研究建立了系统性孢子丝菌病分离株申克孢子丝菌IFM41598容量为3000株的小规模T-DNA随机插入突变体库，筛选并鉴定了6个双相型转换相关基因，构建了这些基因的敲除株和回复突变株，初步解析了基因功能，为深入解析病原真菌的基因功能、探讨致病机制、抗真菌药物的研发奠定基础，对于其它真菌的研究，亦能提供有价值的参考资料。
【作者】万雪；
【导师】王丽；
【作者基本信息】吉林大学，微生物学，2014，硕士
【关键词】申克孢子丝菌；双相型转换；基因；基因敲除；同源重组；

【参考文献】
[1]刘军勇,张留俊.黄土地区公路路基勘察设计问题与分析[J].公路,2014,07:40-45.
[2]朱凯,邱海龙,陈岗,魏英进.钒基氧化物与石墨烯复合材料的制备及其电化学研究[A].中国化学会.第十三届固态化学与无机合成学术会议论文摘要集[C].中国化学会:,2014:1.
[3]葛以踊,彭晖,郭海龙,雷宝龙,万书鹏.调度自动化系统消息总线双网模式交叉故障的解决方案[J].电力系统自动化,2013,21:165-168+207.
[4]肖立颖.组织出卖人体器官罪研究[D].吉林大学,法律,2013,硕士.
[5]李建.工程结构优化的群体智能算法[D].浙江大学,2010.
[6]吴梦洁.Cache Controller的研究和设计[D].华北电力大学（北京）,计算机应用技术,2004,硕士.
[7]张晓文.基于量子免疫算法的移动机器人自定位研究[D].西安科技大学,控制理论与控制工程,2014,硕士.
[8]王向华,王桂兰.商业银行实施客户关系管理(CRM)问题探讨[J].淮北煤炭师范学院学报(哲学社会科学版),2005,05:112-114.
[9]张国杰.经济水平排序下我国中老年人卫生服务利用公平性及其分解研究[D].山东大学,社会医学与卫生事业管理,2013,硕士.
[10]张伟伟,高传强,叶正寅.机翼跨声速抖振研究进展[J].航空学报.
[11]张永林,易启伟,王旺平,周立汉.立式精碾米机机组的设计[J].农业机械学报.2006(10)
[12]袁红楼.浅谈关于我国渔网织机进口的意见[J].现代渔业信息.1993(06)
[13]傅青苗.社会化标签系统中用户标签使用特性研究[D].浙江理工大学,管理科学与工程,2014,硕士.
[14]刘冰清.类水滑石复合脱氟剂的再生及吸附性能研究[D].华中科技大学,环境工程,2013,硕士.
[15]南博君.金融发展对中国制造业结构的影响分析[D].宁波大学,产业经济学,2013,硕士.
[16]徐磊.大型特低扬程泵装置水力性能优化与综合比较研究[D].扬州大学,2012.
[17]吴寅鹤.iOS平台应用程序的安全性研究[D].广东工业大学,计算机应用技术,2014,硕士.
[18]杨春波.幼儿音乐教学及“语境”探析[D].云南艺术学院,音乐学,2013,硕士.
[19]缪丽.某医院内部控制优化研究[D].吉林大学,工商管理,2012,硕士.
[20]李姝.英语中动构式修饰语的选择制约[D].西南大学,英语语言文学,2013,硕士.
[21]张红娣.重掺砷硅单晶中氧沉淀及诱生缺陷的研究[D].河北工业大学,材料物理与化学,2004,硕士.
[22]徐静.辛酰溴苯腈高效降解菌的筛选、降解特性及其细胞固定化研究[D].南京农业大学,环境科学,2012,硕士.
[23]李姗姗,宁洪,陈波,彭绍亮.通用数据仓库元数据模型的研究[J].计算机工程与科学,2004,05:52-55.
[24]谢风伟.民族声乐多样性作品的实践演唱与对比分析[D].云南艺术学院,声乐演唱,2014,硕士.
[25]杨炳儒,綦艳霞.感兴趣度的研究综述[J].计算机科学,2001,10:43-45.
[26]朱冬韵,廖高祖,唐仲豪,李来胜.二氧化钛/石墨烯光催化降解草酸的研究[J].华南师范大学学报(自然科学版),2015,02:67-71.
[27]李文洋.基于基因组重测序比较早实枳与普通枳遗传差异[D].华中农业大学,果树学,2014,硕士.
[28]刘谦,熊四皓,程强.新一代的以太接入网[J].世界电信.2001(02)
[29]轩腾蛟.基于H.264压缩域视频运动对象分割技术的研究[D].湖南大学,信息与通信工程,2011,硕士.
[30]卓尕机.汉藏语法比较与词汇翻译研究[D].西北民族大学,中国少数民族语言文学,2012,硕士.
[31]万文亮.基于ARM的嵌入式多功能终端开发设计[D].北京邮电大学,电子与通信工程（专业学位）,2013,硕士.
[32]熊亮明.广州近代历史建筑色彩特征及保护研究[D].广东工业大学,建筑与土木工程（专业学位）,2013,硕士.
[33].(中国机械工程学报)2014年第27卷第6期目次、摘要[J].机械工程学报,2014,23:207-212.
[34]张展.技工院校招生管理系统设计与实现[D].天津大学,计算机技术,2013,硕士.
[35]吴亮.基于多传感器的航空遥感飞行管理系统开发[D].北京建筑大学,建筑与土木工程,2013,硕士.
[36]黄喆.5-FU联合柳氮磺胺吡啶对人胰腺癌细胞株BxPC-3抗增殖作用及其凋亡相关基因表达实验研究[D].中国医科大学,外科学,2004,硕士.
[37]胡艳平.山西省扫盲运动研究（1950-1956）[D].山西师范大学,中国近现代史,2013,硕士.
[38]蒙汇鹏.“乱笔绘画”的悲剧意象[D].华中师范大学,美术学,2014,硕士.
[39]刘伟.EPON技术在西飞通信专网改造中的应用研究[D].西安电子科技大学,电子与通信工程,2011,硕士.
[40]林创.谈如何建设好装备可靠性的基石——质量师队伍[J].质量与可靠性.2005(03)
[41]李建国.北京智能公交系统规划与建设[J].交通运输系统工程与信息.2003(03)
[42]张彤.朝阳市效能型服务政府建设研究[D].大连理工大学,公共管理学（专业学位）,2013,硕士.
[43]通讯员尤霄峰胡满朝本报记者丁秀玉.科技成就未来创新永无止境[N].科技日报,2014-07-11005.
[44]刘华.竞技体育诚信建设研究[D].河北师范大学,体育人文社会学,2013,硕士.
[45]柴思敏.基于EVA的央企绩效评价体系研究[D].西北大学,会计学,2013,硕士.
[46]郑诚,蔡庆生.基于小波分析的时间序列数据挖掘模型[J].计算机工程与应用,2004,30:26-28.
[47]陈永明.自动闭塞系统改方电路微机化设计[D].吉林大学,软件工程,2014,硕士.
[48]王莉莉.舟山群岛新区建设渔民增收机制与政策研究[D].浙江海洋学院,捕捞学,2013,硕士.
[49]廖彬.EZH2、FHIT和VEGF在膀胱尿路上皮癌的表达及临床意义[D].广西医科大学,泌尿外科,2013,硕士.
[50]石宇立.西安明城区商业建筑地下空间现状分析研究[D].西安建筑科技大学,建筑设计及其理论,2013,硕士.